在生物研究领域，对活体生物样本进行高分辨率、长时间的光学三维成像，是探索生物微观奥秘的关键手段。然而，生物组织对成像光子的强烈散射作用，使得高分辨率光学成像只能局限于样本表层。多光子显微成像技术虽凭借长激发波长和非线性激发特性，在深层成像上有所突破，但高激发功率和长曝光时间带来的光损伤问题，严重制约了其在长时程成像中的应用。

为攻克这一难题，北京大学、国家生物医学成像科学中心程和平 / 王爱民团队研发出双侧双光子显微镜（Duo-2P），相关成果以 “Dual-objective two-photon microscope for volumetric imaging of dense scattering biological samples by bidirectional excitation and collection”为题，发表于 Photonics Research。而北京维快光子的 930nm 飞秒激光器，在这一创新成果中发挥着不可或缺的重要作用。

⬆Duo-2P成像系统

针对组织切片、类器官、发育胚胎和小生物体等体积小、结构致密且高度散射的样本特点，研究团队构建了双物镜的双侧双光子显微镜构型。在该显微镜系统中，正置与倒置的共振扫描双光子显微镜对称分布于样本两侧，它们各司其职，分别负责对样品一半体积进行成像。通过激光路径切换及物镜轴向步进运动，实现交替的逐层光栅扫描成像，最终合成完整的三维图像数据。

⬆ (a) Duo-2P原理示意图。(b) Duo-2P的体积成像时序，上下侧显微镜交替执行光栅扫描与物镜步进，并由来自两个显微镜的Z堆栈图像结合得到样本完整三维图像。(c) Duo-2P的激发与荧光收集时序，上下侧显微镜逐帧分时激发并同时对荧光信号进行收集。

在这一成像过程中，北京维快光子的 930nm 飞秒激光器展现出独特优势。其 930nm 的波长，与多光子显微成像技术所需的长激发波长高度适配，能有效减少生物组织对激发光的散射，为实现更深层次的成像奠定基础。飞秒级别的脉冲宽度，使得激光器在极短时间内释放能量，降低了对生物样本的热损伤和光漂白效应，这对于长时程成像至关重要。

借助 930nm 飞秒激光器的助力，Duo-2P 取得了一系列令人瞩目的成果。它成功将受限于信背比的极限成像深度扩展到两倍以上。以样品厚度为散射长度五倍的情况为例，与传统落射双光子显微镜相比，Duo-2P 在使用 930nm 飞秒激光器后，总激发能量降低了一个数量级，大大减轻了对生物样本的光损伤。对侧额外的荧光收集，配合 930nm 飞秒激光器稳定的激发性能，使得图像质量显著提升，尤其是在样品深层，图像信噪比最多可提高 1.4 倍。双物镜构型结合 930nm 飞秒激光器的高效激发，增加了成像体积，在低散射厚样本的体积成像中，能够实现厚度两倍于物镜工作距离的生物样本的完整体积成像。

⬆Duo-2P中双侧激发与荧光收集的模拟计算。(a) 图1(a)中虚线框内成像腔室放大示意图。(b) Duo-2P与传统双光子显微镜在不同成像深度的激发光功率比较。(c) 在不同样本厚度的体积成像时，Duo-2P与传统双光子的输入能量之比。(d) 成像深度(D)和离焦距离(Δd)对荧光收集效率(η)的影响。(e)与对侧荧光收集效率和荧光强度相关的信噪比增益计算结果。

研究团队通过模拟计算及验证实验，深入分析了 Duo-2P 在厚散射样本中的成像性能。利用与 Duo-2P 匹配的双侧成像腔室，结合 930nm 飞秒激光器稳定的激发光输出，成功对高散射、密集标记的小鼠视交叉上核中数千颗神经元进行了连续 4 小时的钙信号记录。此前，在哺乳动物生物钟时间编码的研究中，Duo-2P 借助 930nm 飞秒激光器，完成了对近万颗神经元跨昼夜的钙活动成像记录，为解析视交叉上核的时间编码机制提供了有力的数据支持。

未来，搭载北京维快光子 930nm 飞秒激光器的 Duo-2P，有望在脑科学、发育生物学及类器官等生物学领域发挥更大作用，为相关研究提供关键的技术支撑，推动生命科学研究迈向新高度。

（北京大学未来技术学院博士生翟慕岳为论文第一作者，北京大学未来技术学院、国家生物医学成像科学中心程和平教授与北京大学电子学院、国家生物医学成像科学中心王爱民副教授为论文通讯作者。该成果得到国家自然科学基金与医学科学创新基金的支持。）

延伸阅读————————————————————————

930nm飞秒激光器在双侧双光子显微镜成像技术中有什么独特的优势？

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1. 波长适配减少散射

   930nm 的波长与多光子显微成像技术所需的长激发波长高度契合。生物组织对成像光子的散射会严重影响成像深度，而该波长能有效减少生物组织对激发光的散射，为实现更深层次的成像提供了基础，使得显微镜可以突破生物组织的限制，对样本进行更深入的观察。

2. 飞秒脉冲降低损伤

   飞秒级别的脉冲宽度是其重要优势。极短的脉冲意味着在极短时间内释放能量，相较于长脉冲的激光器，它能大大降低对生物样本的热损伤和光漂白效应。在对生物样本进行长时程成像时，这种低损伤特性至关重要，能保证样本在成像过程中的活性和稳定性，获取更准确、更完整的成像数据。

   
   

3. 降低激发能量
   
   在双侧双光子显微镜（Duo-2P）中，配合其独特的构型，930nm 飞秒激光器使得总激发能量显著降低。以样品厚度为散射长度五倍为例，与传统落射双光子显微镜相比，使用该激光器的 Duo-2P 总激发能量降低一个数量级，在减少光损伤的同时，也提升了成像的效率和质量。

4. 提升成像质量和范围

   930nm 飞秒激光器稳定的激发性能，结合 Duo-2P 的对侧荧光收集功能，显著提升了图像质量。在样品深层，图像信噪比最多提高 1.4 倍。同时，在双物镜构型下，它还增加了成像体积，在低散射厚样本的体积成像中，能实现厚度两倍于物镜工作距离的生物样本的完整体积成像，扩大了成像的范围和深度。

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